单分子定位成像（Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM）作为分辨率最高的超分辨成像技术，通常需采集数万张稀疏闪烁发光的荧光分子图像，整个过程耗时数分钟。在此期间，样品因环境温度变化、机械振动等因素不可避免地发生位置漂移。对于单通道SMLM，这将导致重建后的超分辨图像模糊失真。对于顺序采集的多通道SMLM，由于滤光片切换振动及探针淬灭等待间隙，会引入未知漂移，导致通道间图像配准（channel alignment）发生错位。

  前期，我院潘雷霆教授、许京军教授团队开发了一种完全基于定位坐标信息的最近邻位置云图算法（Nearest paired cloud, NPC），实现了秒级、分辨率级、强鲁棒性的三维漂移校正，解决了单通道SMLM漂移校正问题，该成果2025年发表于《Nature Communications》。近期，研究团队在SMLM双通道成像配准问题上又取得进展，相关成果以“Residual blinking-driven channel alignment for single-molecule localization microscopy”为题发表于光学成像领域专业期刊《Advanced Imaging》。

  传统通道间配准策略是引入多色荧光微球等外源标记物作为基准。然而，该方法在实际应用中面临明显局限，外源标记物的引入增加了样品制备的复杂性，即微球的空间分布难以控制，分布过稀将导致所选视野内缺失基准标记，分布过密则会遮蔽待观测的本征结构引发成像伪影。潘雷霆教授、许京军教授研究团队提出了一种无标记、基于残余闪烁驱动的配准新方法——ReBling（Residual Blinking-driven channel alignment），采用数据后处理方式，不增加任何硬件和引入外源标记物。常规两个单通道成像数据顺序采集完后，再额外采集一组双波长同时激发的数据，虽然前面单通道采集时大部分荧光分子已被淬灭，但仍有部分未被光漂白，可再次闪烁发光，即“残余闪烁”。由于双波长激发的残余闪烁信号同时包含了来自两个通道的空间信息，同一时刻共享着完全相同的空间坐标系。提取这些共享的定位点作为内在的“配准锚点”，分别与前期顺序采集的第一、第二通道数据进行互相关分析则可给出相对位移量。以残余闪烁数据为共同的坐标参考系，把第一和第二通道坐标统一至同一坐标框架下，将上述相对位移引入后精准实现通道间配准。模拟数据和实验结果表明该方法具有较强的鲁棒性，仅需额外采集约6000帧（耗时约1分钟）的残余闪烁数据即可实现通道间配准。进一步引入外源多色荧光微球评价ReBling配准效果，定量数据分析表明该方法可达到纳米级分辨率水平的配准精度。为验证ReBling配准方法的适用性与可靠性，研究团队选取不同空间分布特征的亚细胞结构进行多样实验验证。检测目标包括连续图案结构（微管与线粒体）、离散点簇结构（红细胞膜骨架蛋白TMOD与Spectrin N），以及图案与点簇混合结构（核孔复合物Nup98与Nup62）。实验结果显示，ReBling配准法可精准助力解析各类亚细胞结构的真实空间互作关系。

  综上，本工作提出的残余闪烁驱动的通道间配准新方法ReBling实现了分辨率级、强鲁棒的SMLM双通间配准。作为一种无外源标记的通用型解决方案，该方法增强了SMLM技术的普惠性与实用性，使人们能够更加便捷、精准地解析亚细胞结构及蛋白分子互作关系。色中色 胡芬副教授与博士后杨建宇为论文共同第一作者，潘雷霆教授为通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划及国家自然科学基金等项目的资助。

  文章链接：//www.researching.cn/Articles/OJe446aba21fb88a87

编校：潘雷霆

审核：任梦昕